液相色谱仪工作原理

一、基本原理：分配系数差异驱动分离

1. 固定相：色谱柱内填充的多孔颗粒材料（如硅胶、聚合物等），根据分离模式（反相、正相、离子交换等）具有不同极性或化学特性。

2. 流动相：携带样品通过色谱柱的液体（如甲醇、乙腈、缓冲盐溶液等），其极性和组成可调节分离效果。

3. 分离机制：

• 样品注入后，各组分在流动相推动下进入色谱柱。

• 极性低的组分与非极性固定相（如 C18）作用力强，在柱内保留时间长；极性高的组分与固定相作用力弱，随流动相快速流出。

• 不同组分因分配系数差异，在柱内迁移速度不同，最终按顺序流出色谱柱，实现分离。

二、核心组件与功能

1. 输液系统

• 高压泵：提供稳定流量的流动相（压力可达几十兆帕），确保样品在柱内快速迁移。

• 溶剂管理器：混合多种流动相（如梯度洗脱），精确控制比例和流速。

2. 进样系统

• 进样器：将样品定量注入流动相（如手动进样阀或自动进样器），避免外界干扰。

3. 分离系统

• 色谱柱：核心部件，内径通常 1-4.6 mm，长度 50-250 mm，固定相填充其中。不同类型色谱柱（如反相柱、亲水作用柱）适用于不同样品。

4. 检测系统

• 紫外 - 可见检测器（UV-Vis）：检测有紫外吸收的组分（如芳香族化合物）

• 示差折光检测器（RID）：通过折射率变化检测无紫外吸收的物质（如糖类），但灵敏度较低。

• 荧光检测器：检测荧光物质（如维生素、药物代谢物），灵敏度高。

• 质谱检测器（LC-MS）：与质谱联用，提供分子结构信息，适用于复杂样品分析。

5. 数据处理系统

• 记录色谱峰的保留时间、峰面积等参数，通过软件计算组分含量或纯度。

三、关键分离模式与应用场景

1. 反相色谱（RP-HPLC）

• 固定相：非极性（如 C18、C8），流动相为极性溶剂（水 + 甲醇 / 乙腈）。

• 应用：分离极性中等至非极性化合物（如药物、脂肪酸、激素）

2. 正相色谱（NP-HPLC）

• 固定相：极性（如硅胶、氨基柱），流动相为非极性溶剂（正己烷、异丙醇）。

• 应用：分离极性化合物（如糖类、甘油酯、手性异构体）。

3. 离子交换色谱（IEC）

• 固定相：带电荷基团（如磺酸基、季铵基），通过静电作用分离离子型物质（如氨基酸、核酸、有机酸）。

4. 尺寸排阻色谱（SEC）

• 固定相：多孔凝胶，按分子尺寸分离（大分子先流出，小分子后流出），用于聚合物分子量分析、蛋白质纯化等。

四、典型工作流程

1. 系统平衡：用初始流动相冲洗色谱柱，直至基线稳定。

2. 样品进样：通过进样器将样品注入流路，随流动相进入色谱柱。

3. 分离过程：组分在柱内按分配系数差异先后流出色谱柱。

4. 检测与记录：检测器实时监测流出组分，生成色谱图（横坐标为保留时间，纵坐标为信号强度）。

5. 结果分析：根据保留时间定性（与标准品对比），峰面积或峰高定量（外标法、内标法）。

五、优势与局限性

• 优势：

• 分离效率高，可分析复杂混合物（如中药提取物、生物样品）。

• 检测灵敏度高（UV 检测器可达微克级，MS 检测器可达皮克级）。

• 流动相选择灵活，适用于极性 / 非极性、热不稳定化合物（无需高温汽化，优于气相色谱）。

• 局限性：

• 样品需溶解于液体，不能直接分析气体或固体。

• 色谱柱易被污染，需定期维护。

• 梯度洗脱时，流动相更换和平衡时间较长。

六、应用领域

• 制药行业：药物纯度检测、杂质分析、手性分离（如布洛芬对映体）。

• 环境监测：水中农药残留（如有机磷、除草剂）、多环芳烃（PAHs）分析。

• 食品分析：添加剂（如防腐剂、色素）、维生素、真菌毒素（如黄曲霉毒素）检测。

• 生物化学：蛋白质分离（如单抗药物）、核酸纯化、代谢物分析（如 LC-MS 代谢组学）。

液相色谱仪通过精准控制分离条件，实现了复杂样品的高效分析，其技术不断向高速度（如超高效液相色谱 UPLC）、高灵敏度（如联用质谱）方向发展，成为现代分析化学的核心工具之一。