高效液相色谱仪使用注意事项

一、样品制备与预处理注意事项

1. 样品纯度与溶解性

• 确保样品溶解于流动相或兼容的溶剂中，避免悬浮颗粒或不溶物（否则会堵塞色谱柱、单向阀或进样器）。

• 若样品含颗粒，必须经0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤（根据色谱柱粒径选择，如 5μm 柱用 0.45μm 滤膜），过滤时使用一次性针式过滤器，避免交叉污染。

• 避免样品中含有强腐蚀性物质（如浓酸、浓碱）或与色谱柱固定相反应的成分（如硅胶柱忌强碱，反相柱忌强极性溶剂过量）。

2. 样品溶剂选择

• 溶剂需与流动相互溶，避免因溶解度差异导致样品析出（如流动相为水 - 甲醇，样品溶剂若为纯乙腈可能引发沉淀）。

• 溶剂强度不宜超过流动相（如反相色谱中，样品溶剂为纯甲醇，而流动相为 50% 甲醇 - 水，可能导致峰展宽或分裂）。

• 挥发性样品需密封保存，避免溶剂挥发改变浓度。

二、流动相配制与使用注意事项

1. 流动相纯度与处理

• 必须使用色谱纯试剂（如甲醇、乙腈）和超纯水（电阻率≥18.2MΩ・cm），避免杂质污染色谱柱或检测器。

• 含水流动相需现配现用，避免长菌

• 缓冲盐溶液（如磷酸盐、醋酸盐）需经减压抽滤（用 0.22μm 水系滤膜）并超声脱气 15-20 分钟，去除气泡（气泡会导致泵压不稳、基线噪音或鬼峰）。

2. 流动相兼容性

• 混合不同溶剂时需缓慢搅拌，避免放热或沉淀（如乙腈与水混合会放热，需冷却后使用）。

• 梯度洗脱时，两种溶剂的互溶性需提前验证（如正己烷与甲醇部分不互溶，可能导致压力骤升）。

• 更换流动相时，需用过渡溶剂冲洗系统（如从水相换为有机相，先用 50% 有机相过渡），避免固定相被破坏（如硅胶柱遇水膨胀，需逐步更换）。

3. 流动相储存

• 含缓冲盐的流动相需冷藏（4℃），使用前恢复至室温并重新脱气，避免温度变化产生气泡。

• 有机溶剂需密封避光保存，防止挥发或降解（如四氢呋喃易氧化生成过氧化物，需定期检查）。

三、仪器操作核心注意事项

1. 泵系统操作

• 开机前确认溶剂瓶内有足够流动相，输液管路过滤器浸入溶剂（避免吸空进气）。

• 启动泵前需排气泡：打开排液阀，以 3-5mL/min 流速冲洗 1-2 分钟，直至流出液无气泡（注意不同溶剂的冲洗顺序，避免沉淀）。

• 设定流速需逐步增加（如从 0.5mL/min 升至 1mL/min），避免瞬间高压损坏泵或色谱柱；最大流速不超过色谱柱耐受范围（如 4.6mm 内径柱通常≤1.5mL/min）。

• 泵压异常时立即停机：正常压力范围因色谱柱和流动相而异，若突然升高（可能堵塞）或骤降（可能泄漏），需排查原因（如更换滤头、检查管路接头）。

2. 进样系统操作

• 手动进样器：

• 进样前用样品溶液冲洗进样针 5-10 次，避免残留污染；针内气泡需排尽（针尖朝上轻弹）。

• 进样量不超过定量环体积的 50%（如 20μL 定量环，最大进样 10μL），否则会导致超载或峰展宽。

• 切换 “Load" 和 “Inject" 状态时动作缓慢，避免压力波动。

• 自动进样器：定期清洁样品瓶和进样针，避免交叉污染；样品盘需保持水平，防止样品泄漏。

3. 色谱柱保护与使用

• 新柱使用前需用纯溶剂冲洗（如反相柱用甲醇冲洗 30 分钟），活化固定相。

• 加装保护柱（与分析柱填料相同），减少样品基质对分析柱的污染。

• 每次实验结束后，需冲洗色谱柱：

• 含缓冲盐的流动相：先用 10%-20% 甲醇 - 水冲洗 30 分钟，去除盐残留（避免结晶堵塞），再用纯甲醇 / 乙腈冲洗 30 分钟保存。

• 反相柱长期保存需浸泡在纯甲醇 / 乙腈中，正相柱需用正己烷保存，两端密封防止干涸。

4. 检测器操作

• 紫外检测器（UV）：

• 开机后需预热 30 分钟，确保基线稳定；检测波长选择样品的最大吸收峰，避开流动相吸收波长（如甲醇截止波长 205nm，乙腈 190nm）。

• 流通池需保持清洁，若有气泡可通过提高流速或轻敲池体排除；污染后可用稀硝酸或甲醇冲洗。

• 荧光检测器：避免强光直射，样品需有荧光活性或衍生化处理；激发 / 发射波长需优化以降低背景噪音。

• 检测器出口管路需保持通畅，避免背压过高（如管路打结会导致流通池损坏）。

四、关机与日常维护注意事项

1. 正确关机步骤

• 实验结束后，按 “流动相冲洗→停泵→关检测器→关主机" 顺序操作，禁止直接断电。

• 若长期不用，需将泵内和色谱柱中的缓冲盐冲洗干净，防止结晶堵塞；溶剂瓶内灌满纯溶剂（如甲醇），避免泵密封件干涸老化。

2. 日常维护要点

• 每周检查输液管路是否有漏液、老化，及时更换破损管路（尤其是接头处）。

• 每月清洁泵的单向阀：若出现压力不稳或流量不准，可拆卸单向阀用甲醇超声清洗（注意区分进出口方向）。

• 定期校准仪器：如泵的流量准确度、检测器的波长精度和灵敏度（用标准品如萘的甲醇溶液校准 UV 检测器）。

• 保持仪器清洁：样品溢出后立即用有机溶剂擦拭，避免腐蚀仪器表面；色谱柱存放于专用柱盒，避免碰撞。

五、安全注意事项

• 有机溶剂（如甲醇、乙腈）具有毒性和易燃性，需在通风橱内操作，远离火源，佩戴手套和护目镜。

• 高压系统（泵压通常 0-40MPa）运行时禁止拆卸管路或接头，防止液体喷射伤人。

• 接触生物样品或有毒介质后，需清洁进样针、样品瓶等，避免交叉污染或健康风险。

遵循以上注意事项可有效延长仪器寿命、保证分析结果的准确性和重现性。操作前务必熟悉所用 HPLC 型号的说明书，针对特殊配件（如制备柱、蒸发光检测器）需额外注意其专用规范。