高效液相色谱仪的主要操作要点 你了解多少？
高效液相色谱仪（HPLC）作为物质分离与定量分析的精密仪器，其操作规范性直接决定分析结果的准确性与重复性。从样品预处理到数据输出的全流程中，每一个操作细节都可能影响最终结果，尤其在制药、食品安全、环境监测等对精度有要求的领域，严格遵循操作要点是保障数据可靠性的关键。以下从前期准备、系统操作、异常处理等维度，详解 HPLC 的核心操作规范。
开机前的准备与系统检查
开机前的准备工作是避免仪器损伤和数据偏差的基础。首先需检查流动相的兼容性与纯度：反相色谱常用甲醇、乙腈等有机溶剂，需确保试剂级别为色谱纯（纯度≥99.9%），避免使用分析纯试剂中的杂质污染色谱柱；水相需采用超纯水（电阻率≥18.2MΩ・cm），并通过 0.22μm 滤膜过滤，防止颗粒物堵塞色谱柱或单向阀。混合流动相需提前计算配比（如乙腈 - 水 = 60:40，体积比），混合后需超声脱气 20 分钟（脱气不充分会导致泵压波动，影响基线稳定性），脱气后的流动相应在 48 小时内使用，避免再次溶解空气。
色谱柱的检查与安装需格外谨慎。使用前需确认色谱柱型号与分析需求匹配（如 C18 柱适用于非极性化合物，氨基柱适用于糖类分析），查看柱效是否在合格范围（通过标准品测试，理论塔板数应不低于出厂值的 80%）。安装时需注意流向标识，柱接头与仪器接口对齐后轻轻拧紧（避免过度用力导致螺纹损坏），连接完成后用 5-10 倍柱体积的流动相冲洗色谱柱（流速 1.0mL/min），排除柱内保存液（如甲醇），使色谱柱达到平衡状态。
仪器各部件的状态检查不可忽视。泵的密封圈需每月检查是否老化（若出现漏液需及时更换），进样器的定量环需确认体积是否与方法匹配（常用 10μL、20μL、50μL），检测器的流通池需清洁无气泡（可通过反向冲洗排除气泡）。对于二极管阵列检测器（DAD），开机前需预热氘灯 30 分钟，确保光源稳定（灯能量应≥800μAU）。
样品处理与进样操作规范
样品处理的质量直接影响分析结果的准确性，需遵循 “代表性、纯净性、适用性" 原则。液体样品需通过 0.22μm 滤膜（有机相样品用尼龙膜，水相样品用混合纤维素膜）过滤，去除颗粒物；固体样品需用合适溶剂溶解（如中药材用甲醇超声提取），提取液经离心（3000r/min，10 分钟）后取上清液过滤。样品溶液的浓度需与检测器灵敏度匹配（如紫外检测器的样品浓度通常在 0.1-10μg/mL），浓度过高会导致色谱峰过载（峰形拖尾或前沿），需稀释至线性范围内。
自动进样器的操作需注意细节控制。样品瓶需使用螺纹口瓶（避免进样针穿刺时漏液），样品体积不低于瓶体积的 1/3（防止进样针吸空），瓶盖垫需选用与溶剂兼容的材质（如聚四氟乙烯垫耐有机溶剂）。进样前需用样品溶液冲洗进样针 3-5 次（冲洗体积为定量环体积的 3 倍以上），避免残留样品污染。手动进样时，需遵循 “进样 - 切换阀 - 保持 - 复位" 的步骤：将进样针插入样品溶液，缓慢抽取过量样品（约为定量环体积的 2 倍），排出气泡后将针插入进样口，推动活塞至定量环充满，切换阀至 “进样" 位置，保持 1-2 秒后复位，整个过程需避免引入气泡（气泡会导致峰面积偏小）。
进样量的设置需根据方法要求精准控制。对于痕量分析（如农药残留检测），可适当增大进样量（如 50μL）以提高灵敏度；而复杂基质样品（如血液、土壤提取液）需减少进样量（如 5μL），避免污染色谱柱。进样后需记录样品编号与进样顺序，确保数据与样品对应，尤其在批量分析时需建立样品登记表格，防止混淆。
色谱参数设置与系统优化
色谱参数的合理设置是实现高效分离的核心。流速需根据色谱柱规格调整：4.6mm 内径的色谱柱常用流速 1.0mL/min，2.1mm 内径的细径柱常用 0.3-0.5mL/min（流速过高会导致柱压超过仪器上限，通常不超过 40MPa）。柱温箱温度需稳定（波动≤±0.1℃），反相色谱常用 30-40℃（升高温度可改善峰形，缩短保留时间），而手性分离等特殊分析需精确控制温度（如 25℃±0.5℃）。
检测器参数需与目标物特性匹配。紫外检测器需选择最大吸收波长，带宽设置 2-4nm（提高信噪比）；荧光检测器需优化激发波长与发射波长（如黄曲霉毒素 B1 的激发波长 365nm，发射波长 435nm）；
数据记录与系统维护
数据记录与处理需符合溯源性要求。每次分析需记录仪器型号、色谱柱信息、流动相配比、流速、柱温、检测波长等参数，保留原始数据文件（包括色谱图、峰面积、保留时间），不可随意删除或修改。定量分析时需采用标准曲线法：配制 5-7 个浓度的标准溶液，按浓度递增顺序进样，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线，相关系数（R²）需≥0.9990，否则需重新配制标准溶液。
分析结束后的系统维护是延长仪器寿命的关键。需用纯溶剂冲洗色谱柱：反相柱先用 10% 甲醇水溶液冲洗 30 分钟（去除水溶性杂质），再用甲醇冲洗 30 分钟（保存色谱柱）；正相柱需用正己烷冲洗，避免柱内残留极性溶剂。泵的维护需在关机前用纯甲醇或乙腈冲洗 10 分钟，防止盐溶液结晶堵塞单向阀（若流动相含缓冲盐，需先用水冲洗 30 分钟，再用有机溶剂冲洗）。
检测器的维护需针对性进行：紫外检测器需关闭氘灯（延长使用寿命），流通池若污染可用 10% 硝酸冲洗；RID 检测器需确保参比池与样品池的溶剂一致，关机前需冲洗干净；DAD 检测器需记录氘灯使用时间（累计使用超过 2000 小时需更换）。仪器使用完毕后需填写操作记录，包括使用时间、样品数量、仪器状态、异常情况等，为后续维护提供依据。
常见异常情况处理
分析过程中需及时应对常见异常，确保数据可靠性。若出现基线漂移（漂移量超过 0.5mAU/h），可能是流动相比例不稳定或柱温波动，需检查泵的混合精度、柱温箱温度；若基线噪音过大，需排查检测器是否污染、流动相是否有杂质，可更换新流动相或清洗流通池。
色谱峰异常的处理需针对性分析：峰拖尾可能是色谱柱污染（需冲洗或更换色谱柱）、流动相 pH 不当（调整 pH 至目标物 pKa±2 范围）；峰分裂可能是进样量过大（减少进样量）、样品溶剂与流动相不兼容（调整样品溶剂）；保留时间漂移可能是流动相比例变化（检查泵的单向阀）、柱温变化（校准柱温箱）。
系统压力异常需立即停机检查：压力过高可能是管路堵塞（依次断开各部件排查堵塞点）、色谱柱污染（反冲色谱柱）；压力过低可能是漏液（检查各接头是否拧紧）、泵故障（更换密封圈）。处理压力异常时需缓慢降低流速，避免压力骤变损坏色谱柱。
高效液相色谱仪的操作是一门 “精细活"，需要操作人员兼具理论知识与实践经验，从样品处理到数据输出的每一步都需严谨把控。规范的操作不仅能保障分析结果的准确性与重复性，更能延长仪器使用寿命，降低维护成本。在制药、食品等严格监管领域，操作记录的完整性与规范性更是符合 GMP、ISO 等认证要求的关键，因此，建立标准化操作流程（SOP）并严格执行，是高效液相色谱分析工作的核心保障。
高效液相色谱仪的功能有哪些呢？
