一、仪器简介
高效液相色谱仪（HPLC）是实验室常用精密分析设备，主要由高压输液泵、进样系统、色谱柱、检测器、柱温箱及数据工作站组成。适用于食品、化工、环保、质检等行业，用于样品成分分离、定性检测、定量分析及纯度检测，具有分离效果好、精度高、重复性稳定的特点。
二、实验前准备
1. 流动相准备
所有流动相必须使用色谱纯试剂，纯水建议使用超纯水。配制完成后，需经过滤膜过滤处理，水系溶液用水系滤膜，有机溶液用有机滤膜，去除杂质防止堵泵、堵柱。过滤完成后进行超声脱气15至20分钟，排出液体内部气泡，避免运行中压力波动、基线漂移、杂峰干扰。含盐、缓冲盐流动相需现配现用，不可隔夜使用，防止滋生细菌、结晶堵塞管路。
2. 样品准备
样品需用匹配溶剂或流动相充分溶解，确保无沉淀、无悬浮颗粒。样品溶液必须经过0.22微米滤膜过滤，去除微小杂质，避免污染色谱柱和进样阀。样品浓度不宜过高，浓度过大容易造成柱过载、峰形变差、拖尾严重；浓度过低会导致响应值低、检测误差偏大。
3. 设备检查与色谱柱安装
开机前检查电源线、信号线、管路接口是否完好，废液瓶是否清空，溶剂瓶干净无杂质。安装色谱柱时严格按照柱体箭头流向安装，不可反装，接头适度拧紧，避免漏液或压力异常。新色谱柱或长期未使用的色谱柱，需先用纯甲醇低流速冲洗活化，稳定柱体状态。
三、开机操作流程
严格按照顺序开机，禁止乱序操作。首先打开高压输液泵电源，设置压力上限保护，防止超压损坏设备；其次打开柱温箱电源，设定所需恒温温度；再打开检测器电源，提前预热30分钟保证光源稳定；最后打开电脑及工作站软件，连接仪器，等待设备自检完成。
开机后先打开排液阀，开启 purge 排气功能，排出管路内部空气，直至流出液体无气泡，关闭排液阀。使用纯有机相冲洗管路和色谱柱，待系统稳定后切换至实验所需流动相，平衡系统基线，直至压力稳定、基线平直后方可进样检测。
四、参数设置与样品检测
根据实验方法设置参数，常规色谱柱流速设置为1.0毫升每分钟左右，柱温控制在25至40摄氏度，根据检测物质设定对应紫外波长。进样体积根据标准方法设定，常见为5至20微升。
手动进样时，将进样阀调至加载位置，用微量注射器吸取无气泡样品，平稳注入进样口，快速切换至进样位置，同时点击工作站开始采集数据。自动进样模式只需在软件中设置样品序列、进样量、循环次数，设备即可自动完成进样、分离、检测、保存数据。
检测过程中观察压力变化、基线状态和出峰情况，正常图谱峰型对称、无杂峰、无严重拖尾，压力保持平稳。通过保留时间进行定性分析，通过峰面积完成定量计算。
五、实验结束清洗与关机步骤
实验结束不可直接关机，必须先清洗系统保护色谱柱。若使用过缓冲盐、含盐流动相，需先用纯水或低比例甲醇水冲洗管路及色谱柱，冲净盐分，防止结晶堵塞。随后更换高比例有机相继续冲洗，最后用纯甲醇或乙腈保存色谱柱，保证柱内充满有机溶液，防止干柱、发霉、填料损坏。
关机顺序遵循先关检测器、再停泵、最后关闭柱温箱及电脑软件的原则。全部断电后整理管路、清理废液、登记设备使用记录，色谱柱两端装好密封帽妥善存放。
六、重要注意事项
设备运行期间禁止随意打开机箱、触碰高压管路，防止漏液、高压冲击。禁止突然启停流速，避免压力骤变导致柱床塌陷。流动相需匹配色谱柱耐受酸碱度，强酸强碱环境会损坏色谱柱填料。严禁使用未过滤、未脱气的流动相和样品上机。日常使用保持仪器干燥、洁净，定期更换泵密封垫、单向阀，定期校准检测器，保证检测精度。长期不用设备需每周开机冲洗保养一次，延长仪器与色谱柱使用寿命。
