高效液相色谱仪的主要操作要点 你了解了吗？

一、开机前准备：排除风险，确保仪器 “就绪"

1. 流动相检查与制备

• 溶剂需用色谱纯级（如甲醇、乙腈），水需为超纯水（电阻率≥18.2 MΩ・cm），避免杂质污染色谱柱或检测器；

• 若流动相含缓冲盐（如磷酸盐、醋酸盐），需用 0.22 μm 滤膜减压抽滤（有机相用有机相滤膜，水相用水相滤膜），防止盐结晶堵塞管路；

• 混合流动相（如甲醇 - 水 = 7:3）需先混合再超声脱气（脱气时间 5-10 分钟），或通过仪器在线脱气机，避免气泡进入泵体导致压力波动、基线噪音。

• 流动相需符合 “无杂质、无气泡、适配色谱柱" 原则：

2. 色谱柱检查

• 确认色谱柱型号与实验需求匹配（如反相柱 C18、正相柱 SiO₂），检查柱芯是否松动、柱效是否正常（可通过标准品验证）；

• 若长期未使用，需先查看柱保存液（如 C18 柱常用甲醇保存），若流动相与保存液极性差异大（如保存液为甲醇，流动相为水），需用 “过渡流动相"（如 50% 甲醇 - 水）缓慢冲洗 20-30 柱体积，避免柱床塌陷。

3. 仪器状态检查

• 检查输液泵、进样器、柱温箱、检测器（如紫外检测器）的电源、数据线是否连接正常；

• 紫外检测器需提前预热（通常 30 分钟），确保灯源（氘灯 / 钨灯）能量稳定（能量值需符合仪器要求，如氘灯能量≥800）。

二、开机与系统平衡：让系统进入 “稳定状态"

1. 开机顺序：遵循 “先低后高、先泵后检测器"

• 先打开计算机与色谱工作站，再依次开启输液泵、柱温箱、检测器，避免仪器电路冲击；

• 柱温箱需设置目标温度（如 25℃、30℃，波动≤±0.1℃），待温度稳定后再启动泵（防止温度变化导致流动相粘度波动，影响流速）。

2. 流动相流速与梯度设置

• 启动输液泵时，先以低流速（如 0.2-0.5 mL/min） 冲洗管路，逐步升至目标流速（如 1.0 mL/min），避免突然高压冲击色谱柱；

• 若用梯度洗脱，需在方法中设置 “梯度程序"（如时间 0-10min，甲醇从 5% 升至 95%），确保梯度平滑无突变。

3. 系统平衡判断

• 平衡核心是 “基线稳定"：紫外检测器基线漂移≤0.01 mAU/h，噪音≤0.005 mAU；

• 若流动相含缓冲盐，需平衡 30-60 分钟（或 20-30 柱体积），直至压力、基线无波动，再进样分析。

三、样品处理与进样：避免污染，保证重复性

1. 样品预处理：关键在 “纯净度与溶解性"

• 样品需溶解于流动相（或与流动相兼容的溶剂），避免沉淀堵塞进样阀或色谱柱；

• 用 0.22 μm 滤膜（与样品溶剂匹配）过滤样品，去除悬浮杂质；若样品浓度过高，需用流动相稀释至线性范围内（通过标准曲线验证）。

2. 进样操作：控制 “精度与一致性"

• 进样器（如 10 μL、20 μL 定量环）需提前用样品溶液润洗 3-5 次，避免残留溶剂影响样品浓度；

• 手动进样时，需 “快速切换阀位"（从 “Load" 到 “Inject"），且每次进样速度、力度一致；自动进样器需检查样品瓶密封性，避免溶剂挥发。

3. 进样后观察

• 进样后实时监控压力、基线：若压力突然升高（如超过柱压上限），需立即停泵，排查是否有堵塞；若峰形异常（如拖尾、分裂），需检查样品是否污染或色谱柱是否失效。

四、数据分析与记录：确保结果 “准确可追溯"

1. 数据采集与积分

• 色谱工作站需设置合理的采集参数（如采样频率 10 Hz，积分阈值 0.001 mAU），避免漏峰或积分误差；

• 手动积分时，需统一积分起点、终点（如峰高 10% 处），确保同批次样品积分标准一致。

2. 结果验证与记录

• 用标准品验证系统适用性：理论塔板数（N）≥2000（反相柱 C18），分离度（R）≥1.5，重复性（RSD）≤2%（n=5 次进样）；

• 详细记录实验信息：流动相组成、色谱柱型号、柱温、流速、进样量、标准品浓度、样品编号、峰面积 / 峰高、计算结果等，确保数据可追溯。

五、关机后维护：延长仪器寿命的核心

1. 流动相清洗：重点在 “防盐结晶"

• 若流动相含缓冲盐（如磷酸盐），关机前需用 “过渡流动相"（如 5% 甲醇 - 水）冲洗管路 + 色谱柱 30-40 分钟（或 30 柱体积），再用纯有机相（如甲醇、乙腈）冲洗 20-30 分钟，避免盐在管路或柱内结晶（结晶会堵塞管路、破坏柱床）；

• 若流动相为纯有机相（无盐），直接用纯有机相冲洗 15-20 分钟即可。

2. 仪器部件维护

• 进样阀：用甲醇冲洗进样口（Load 状态下，注入 100 μL 甲醇，切换阀位冲洗），避免样品残留；

• 检测器：关闭检测器灯源（氘灯寿命约 2000 小时，非使用时及时关闭，延长寿命），若长期不用，需用甲醇擦拭流通池窗口，防止污染。

3. 环境与记录

• 关闭仪器电源、计算机，清理实验台；记录仪器使用时间、灯源寿命、色谱柱使用次数等，为后续维护提供依据。

关键禁忌提醒

• 严禁用 “腐蚀性溶剂"（如浓酸、浓碱）直接进入色谱柱（除非柱明确耐腐）；

• 严禁在 “无流动相" 状态下启动泵（会导致泵体干磨，损坏密封圈）；

• 严禁样品中含 “固体颗粒或不溶物"，否则会直接堵塞色谱柱，不可逆损坏柱效。

高效液相色谱仪都在哪些领域得到广泛应用呢？