仪器状态确认：开机前检查电源、数据线连接是否牢固，样品室门是否关闭（部分仪器需 “关门" 状态才能启动），检测器、光源（如氙灯）是否处于正常待机状态（氙灯寿命有限，避免频繁开关）。
环境控制：
温度：保持实验室温度稳定（通常 20-25℃），避免温度波动导致仪器部件（如光电倍增管）灵敏度变化；
湿度：湿度≤60%，防止光学元件受潮发霉（可配备除湿机）；
避光：关闭样品室附近强光（如直射灯光），避免环境光干扰荧光信号检测；
防震：仪器需放置在稳定台面上，远离离心机、真空泵等震动源，防止光学系统错位。
试剂纯度：空白溶剂（如去离子水、乙醇）需 “荧光级" 或高纯度（如 HPLC 级），避免杂质自身荧光干扰；标准品需准确称量、配制，浓度梯度覆盖样品预期浓度（通常 5-7 个梯度，确保线性关系）。
样品预处理：
去除杂质：若样品含悬浮物、颗粒物，需通过离心（3000-5000rpm，5-10min）或 0.22μm 滤膜过滤，防止堵塞样品池或散射光干扰；
浓度适配：样品浓度过高易导致 “荧光猝灭"（信号饱和），需提前稀释至线性范围内（可先做预实验判断浓度范围）；
pH 调节：部分物质荧光强度受 pH 影响显著（如氨基酸、黄酮类），需用缓冲液（如 Tris-HCl、磷酸盐缓冲液）调节样品与标准品 pH 一致。
材质适配：
常用石英样品池（透光性好，紫外 - 可见区无吸收），避免使用玻璃池（玻璃对紫外光有吸收，会削弱激发光）；
根据样品体积选择规格（如 10mm 光程、3.5mL 容量的石英池为常规款），确保样品量覆盖光程（液面需高于进光孔 2-3mm）。
清洁流程：
新样品池先用 10% 硝酸浸泡 2-4h，再用去离子水冲洗 3-5 次，烘干备用；
每次使用后，立即用样品溶剂（如乙醇）冲洗 3 次，再用去离子水冲洗，最后用无尘纸吸干外壁水分（避免擦拭内壁，防止划痕）；
若样品残留（如蛋白质、油脂），可用超声清洗仪（20-30℃，5-10min）清洗，禁用强腐蚀性试剂（如浓盐酸）。
打开电脑，启动荧光光度计控制软件（如 PerkinElmer 的 FL WinLab、Hitachi 的 F-7000 软件）；
开启仪器主机电源，选择 “氙灯" 或对应光源（部分仪器需手动点亮光源），预热 30min（关键步骤！光源和检测器需稳定后才能检测，否则信号漂移大）；
预热期间，在软件中设置仪器参数（提前规划，减少预热后等待时间）。
| 参数类别 | 设置要点 |
|---|---|
| 激发波长（λex） | 先通过 “激发光谱扫描" 确定：固定发射波长（参考文献或预实验值），扫描激发波长范围（如 200-500nm），取荧光强度最大的波长作为 λex（避免干扰峰）。 |
| 发射波长（λem） | 固定 λex，扫描发射波长范围（如 300-600nm），取荧光强度最大的波长作为 λem（注意：λem 需大于 λex，避免激发光散射干扰，即 “斯托克斯位移"）。 |
| 狭缝宽度 | 激发狭缝、发射狭缝宽度越小，单色性越好，但光强越弱（灵敏度降低）；反之则光强高，但杂散光增多。常规设置：2-10nm（浓度低时选宽狭缝，浓度高时选窄狭缝）。 |
| 光电倍增管电压（PMT） | 电压越高，灵敏度越高，但背景噪声也会增加。设置原则：空白溶剂的荧光强度≤5% 满量程（避免过载），通常在 400-800V 之间（不同仪器范围不同）。 |
| 扫描速度 | 定性扫描（找波长）可慢（如 100nm/min），确保峰形清晰；定量检测可快（如 300nm/min），提高效率（但需确认速度不影响信号稳定性）。 |
目的：扣除溶剂、样品池、环境光的背景荧光信号，确保检测信号仅来自待测物质。
操作：将空白溶剂注入石英池（液面至刻度线，避免外壁残留液体），用无尘纸擦拭外壁后，放入样品室的 “样品架" 中（注意方向：光程面正对光路，不可反放），点击软件 “空白校正" 或 “调零"，待校正完成后取出空白池。
按浓度从低到高的顺序，依次将标准品溶液注入样品池，放入样品室，点击 “测量"，记录每个浓度对应的荧光强度（F）；
测量完一个标准品后，用下一个标准品溶液润洗样品池 2-3 次（避免交叉污染），再注入新溶液测量；
全部标准品测量完成后，在软件中以 “浓度（C）" 为横坐标、“荧光强度（F）" 为纵坐标，生成标准曲线，计算线性回归方程（R² 需≥0.998，否则需重新配制标准品）。
用样品溶液润洗样品池 2-3 次，注入样品溶液，放入样品室，点击 “测量"，记录样品的荧光强度（F 样）；
若样品需稀释，需记录稀释倍数（n），将 F 样代入标准曲线方程，计算样品的 “稀释后浓度"，再乘以 n 得到 “样品原始浓度"；
每个样品建议平行测量 3 次，取平均值（相对标准偏差 RSD 需≤5%，确保重复性）。
关闭光源（如氙灯），等待仪器冷却 10-15min 后，关闭主机电源和电脑；
立即清洗样品池（按 “操作前准备" 中的清洁流程），晾干后收纳；
清理样品台，记录仪器使用日志（包括使用时间、样品类型、光源状态、异常情况等）；
关闭实验室电源、空调、灯光，确保环境安全。
氙灯启动后需预热稳定，禁止在预热过程中关闭电源（易导致灯管损坏）；
单次使用时间不宜过长（建议≤4h），若中途暂停实验，可开启 “待机模式"（部分仪器有此功能），而非频繁开关光源。
拿取样品池时，仅接触磨砂面（避免指纹污染透光面，指纹会产生散射光，干扰信号）；
样品池放入样品室时，需确保 “定位准确"（部分仪器样品架有卡槽），若位置偏移，会导致光程不一致，数据偏差。
避免样品中含强荧光杂质（如灰尘、有机物），若空白信号过高，需更换更高纯度的溶剂或重新预处理样品；
检测过程中禁止打开样品室门（开门会导致环境光进入，信号骤升，甚至损坏光电倍增管）。
标准曲线线性差：检查标准品是否变质、配制是否准确，或仪器参数（如狭缝、PMT 电压）是否合适；
样品信号饱和（超过满量程）：需稀释样品后重新检测，避免 “荧光猝灭" 导致结果偏低；
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